Fehlregulierte Signalwege ETV6/RUNX1 positiver ALL im Kindesalter

Akute lymphoblastische Leukämie (ALL) tritt als größte Gruppe maligner Erkrankungen bei Kindern auf. Hier weist sich die ETV6/RUNX1 Genfusion als am häufigsten vorkommende chromosomale Translokation (t(12;21)(p13;q22)) in B-Vorläuferzell-ALL (BVZ-ALL) aus. Sowohl ETV6 als auch RUNX1 kodieren für Transkriptionsfaktoren, die für die Regulation der Zellproliferation mitverantwortlich sind. Diese Genfusion beeinträchtigt die normale hämotopoetische Differenzierung, wodurch die Entstehung von präleukämischen Zellpopulationen multipotenter Progenitorzellen mit einer Differenzierungsblockade von pro-B ins prä-B Stadium gefördert wird. Das chimäre Fusionsprotein fungiert dabei als Repressor von RUNX1 aktivierbaren Genen. Die ETV6/RUNX1 Genfusion löst allerdings alleine nicht eine ALL aus. Weitere Mutationen führen zur malignen Entartung. Das ETV6/RUNX1 positive ALL Expressionsprofil unterscheidet sich deutlich von anderen Leukämien. In bisherigen Studien wurden jedoch selten Vergleiche mit normalen hämatopoetischen Zellen durchgeführt. Eine vergleichende Analyse des ETV6/RUNX1 positive ALL Expressionsprofils mit dem Expressionsprofils normaler hämatopoetischer Zellen, wie pro-B Zellen und hämatopoetischen Stammzellen, soll signifikant gestörte Signalwege identifizieren. Da die Rezidivrate dieser spezifischen ALL hoch liegt, wird ebenfalls eine Analyse der Signalwege dieser Gruppe durchgeführt. Signalwege, die als signifikant verändert identifiziert wurden, werden auf Angriffspunkte für Inhibitoren untersucht. Da die ETV6/RUNX1 Genfusion in allen Erkrankungsstadien vorliegt, bietet sich dieses Fusionsonkogen als therapeutisches Target an. Ziel ist es, eine Leitstruktur zur Inhibierung der Di-/Polymerisierung von ETV6/RUNX1 zu entwickeln.

Development and preclinical testing of small molecule activators of the pro-apoptotic Bcl-2 homolog Bak

Apoptosis is mediated through at least three major pathways that are regulated by the death receptors, the mitochondria and the endoplasmic reticulum (ER). In most cells, these pathways are controlled by the Bcl-2 family of proteins that can be divided into anti- and pro-apoptotic members. Although the overall amino acid sequence homology betweenthe family members is relatively low, they contain highly conserved domains, referred to as Bcl-2 homology domains (BH1 to -4) that are essential for homo- and heterocomplex formation as well as for their cell death inducing capacity. Structural and functional analyses revealed that the pro-apoptotic homologs can be subdivided into the Bax subfamily and the growing BH3-only subfamily. Recent data indicate that BH3-only proteins act as mediators that link various upstream signals including death receptors and DNA damage signaling to the intrinsic apoptosis pathway that is amplified by the mitochondria and the ER. The aim of this project is to utilize recent structural and functional insights how these subfamilies promote or inhibit cell death signals and how these structural properties may be employed for development of apoptosis-promoting small molecules e.g. in cancer therapy. Induction of apoptosis in cancer is, however, frequently hampered due to the loss of the pro-apoptotic Bcl-2 homolog Bax, a multidomain protein carrying a BH1 to 3 domain. In contrast, our own data delineate that expression of the Bax homolog Bak is often retained in malignant tumors. This is of considerable interest as Bak can functionally complement loss of Bax. Nevertheless, activation and function of Bak appears to be impaired due to expression of endogenous Bak inhibitors in many tumor cells. A high-throughput-surface simulation scan of proteins involved in this inhibitory regulation of Bak will yield binding peptides that are tested for their propensity to overcome Bak inhibition in cancer. These peptides will be optimised and converted into low molecular weight compound using peptoids and further peptidomimetic strategies to identify small-molecule peptidomimetics as Bak activators. Their potency of apoptosis induction will be checked in established systems and successful candidates will be characterised concerning therapeutic applicability.

Major topics are:

• the retrieval of peptide inhibitors from the Dictionary of Interfaces in Proteins,
• the development of methods for the design of non-peptidic ligands,
• the proposal of new ligands for a medical relevant target,
• the design of a functional enzyme with exchanged secondary structural elements,
• the prediction of (non-linear) epitopes and (unknown) binding sites.

For details see: http://www.bcbio.de

Kartierung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen mittels Peptid-Bibliotheken

Die Wechselwirkungen von im Rahmen des beantragten SFBs zu untersuchenden Rezeptoren mit ihren natürlichen Liganden sollen mittels Cellulose gebundener Peptid-Bibliotheken (Peptidarrays) untersucht werden. Ausgangspunkt der meisten Rezeptor-Ligand Kartierungsstudien ist der wissensbasierte Ansatz. Überlappende Peptide (Pepscan) welche die Primärstruktur eines der Interaktionspartner abbilden, werden mittels SPOT Synthese als Array auf einer Cellulosemembran synthetisiert. Die sich anschließende Inkubation mit dem zugehörigen Interaktionspartner erlaubt die Identifikation jener bindenden Abschnitte der Primärstruktur (Epitope), welche die Interaktion zwischen Rezeptor und Ligand vermitteln. Zusätzliche Substitutions- und Längenanalysen ergeben dann ein detailliertes Bild der Interaktionsbereiche. Diese Bindungsbereiche können sowohl linearer als auch diskontinuierlicher Natur sein. Insbesondere für die Kartierungsstudien von Protein-Protein Interaktionen, die auf der Erkennung linearer Epitope beruhen, hat sich die SPOT Synthese Technologie bestens ewährt.

Prinzipiell kann die SPOT Technologie aufgrund ihrer hohen Sensitivität auch zur Kartierung diskontinuierlicher Epitope angewandt werden. Die Tatsache, dass die Einzelbereiche eines diskontinuierlichen Epitopes, die in der Primärstruktur getrennt, jedoch im gefalteten Protein räumlich benachbart sind, eine im Vergleich zum kompletten Protein deutlich geringere Affinität zum Bindungspartner aufweisen, erschwert jedoch die Differenzierung zwischen spezifischer- und unspezifischer Bindung. Trotz einiger Erfolge, beruhend auf ausgefeilten Inkubationsbedingungen und Elektrotransfermethoden, stößt die SPOT Technologie hier an ihre Grenzen. Wir möchten durch Einbindung eines theoriegestützten Ansatzes, dem strukturgestützten Peptid-Bibliothek-Design, die Kartierung diskontinuierlicher Protein-Protein Bindungsbereiche zuverlässiger gestalten.

In silico characterisation of the binding of agonistic autoantibodies to optimised conformational epitopes of GPCRs

With aid of the bioinformatical methods established in the Preissner group, the binding regions of G-protein coupled receptors (GPCR: alpha1-, alpha2-, beta1-receptor) to agonistic autoantibodies (AAAB) will be mapped. The goal is to identify clearly restricted non-linear (conformational) epitopes, which potentially can cause fatal autoimmune diseases. A crucial step is the characterisation of the binding features of these epitopes to specific AAABs and hence the validation of the bioinformatical predictions. The pepdidic epitopes will be produced by solid phase synthesis for this purpose. Their binding to AAABs will be analysed in detail within the laboratories of E.R.D.E. with aid of plasmon resonance measurements and measurements of binding kinetics and thermodynamics. A feedback step will be established to achieve an iterative improvement of the binding properties by directed variation of the peptides and by stepwise adjustment of the bioinformatical tools and approaches. The goal is thus the in silico and in vitro characterisation of the GPCR-AAABs binding using optimised conformational epitopes. The possibility to detect conformational peptides representing optimal, highly specific binding partners of certain AAABs can further be basis for the fast detection of binding for this highly relevant antibody family.

"Genomics and Systems Biology of Molecular Networks"

Integration of experimental and structural data into drug-target-networks

In this project experimental data on growth inhibition and altered gene expression for 60 cell lines caused by 50,000 compounds will be integrated in a pathway oriented compound-target database. Characteristic cellular fingerprints describing the effects of compounds on cell growth will be deduced. Suitable structural compound representations as well as similarity measures have to be developed. A searchable drug-target database comprising information on sequence (variability) and structure of the targets, possible drug binding sites and the location in functional networks is an ambition of this project. Via in silico screening with the newly developed cellular fingerprints it is aimed to propose novel compounds exhibiting distinct pattern of action on specific types of cells, which will be validated experimentally.

For details see: http://www2.hu-berlin.de/biologie/irtg/

Ziel des "Immunotox"-Verbundprojektes ist es, das toxische Potential von Substanzen auf das Immunsystem zu identifizieren und vorherzusagen. Dabei wird die Charakterisierung biologischer Marker und Stoffwechselwege mittels verschiedener Methoden aus der Zell-, Protein- und Metabolismus-Biologie sowie bioinformatische Analysen kombiniert. Durch die Universität Greifswald werden ausgewählte Substanzen an menschlichen Zelllinien des Immunsystems zunächst einem Screening hinsichtlich ihrer Toxizität unterzogen, um dann spezifischere Methoden zur weiteren, detaillierteren Charakterisierung zu nutzen. Untersuchungen zur Gesamtheit der durch die Substanzen beeinflussten Proteine und Stoffwechselprodukte sollen im nächsten Schritt die Ergebnisse der zellbiologischen Untersuchungen bestätigen. Im Einzelnen wird die veränderte Biosynthese ausgewählter Proteine, die in den Immunzellen in „Stressreaktionen“ und den programmierten Zelltod involviert sind, sowie die veränderte Biosynthese spezifischer Rezeptoren des Immunsystems unter Verwendung der 2D-Gelelektrophorese-Methode untersucht. Diese Untersuchungen der Stoffwechselprodukte dienen der Klärung, ob die Substanzen den Zustand des Stoffwechsels der Immunzellen beeinflussen. Nach Anpassung der Methodik für weitere Zelltypen, werden sowohl der intra- als auch der extrazelluläre Pool an Stoffwechselprodukten gemessen. Der Projektpartner an der Charité in Berlin wird die Daten begleitend bioinformatisch bearbeiten/modellieren, um zu einer Datenbank und Vorhersage der toxischen Wirkung auf das menschliche Immunsystem zu gelangen.